我參加了Josh Quick在PoreCampAU 2017上的演講，他在演講中討論了獲得良好測序產量和長讀取長度的一些常見障礙。它主要歸結為對樣品製備更加謹慎。請記住，MinION仍會對骯髒的樣品進行測序，產量會降低。這是我從演講中得到的筆記：

• MinION測序最困難的是首先獲得樣品
• 有許多不同的樣品類型和提取方法
• 讀取的內容不能超過您輸入的內容；糞便會導致糞便。
• DNA在不移動時非常穩定，但對側向損傷非常敏感
• DNA提取中的酚氯仿方法非常好，可以與鎖相凝膠使提取更容易
• 簡單的鹽+酒精提取可能是提取的最佳方法（因為它涉及的DNA量最少）
• EDTA （例如，在TE緩衝液中發現的，以及許多提取試劑盒）與快速試劑盒不兼容
• Josh實驗室生產的最一致的納米孔運行是在R9.4上進行一維連接。最好的整體運行方法是使用苯酚-氯仿萃取+快速試劑盒
• John Tyson可以將自己調出低產率的孔（通過軟件）
• 獲得少量的短讀本是建議的（非常未經測試的）純化技術非常重要
：離心柱（60-100kb）；乙醇萃取（100-150kb），透析（150-250kb）;低熔點瓊脂糖塞（〜1Mb，DNA原位提取）
• 納孔協議輸入值以納克為單位，但實際上應表示為摩爾濃度；該試劑盒預期輸入約0.2 pmol
• 將分子束縛在膜表面。然後您會看到流通池密度與序列長度無關
• Tapestation，Qubit和Nanodrop都是好主意；可以通過所有三個測試的DNA樣品可以很好地工作：Tapestation不能提供短肩膀，Qubit不能提供足夠的DNA，Nanodrop
• RNA可以提供高純度，可以乾擾測序。建議消化RNA
• 凍結DNA是一個非常糟糕的主意。冰晶非常擅長將DNA切成小塊
• 保存在冰箱中的DNA非常穩定；可以保存兩年以上（可能無限期）

產量更新：

我們於2018年6月進行了一次運行，從PCR-擴增的小鼠cDNA（N50讀到〜1kb），這是某人製備的第一個樣品，輸入的DNA量可能約為應有的20％，並且我們遭受了數據丟失事件。如果那是一次糟糕的運行所發生的情況，那麼我對我們的未來運行抱有很高的希望。

我們在2018年8月運行的下一個cDNA運行中產生了約700萬個讀數和類似讀數的N50（即總產量7Gb）。運行的第一天晚上被Windows更新中斷（我之前禁用了自動更新，但已將其重新啟用），此後又進行了其他軟件和硬件更新，以提高測序產量。如果我們有一個良好的流通池和類似的樣品製備方法，我希望我們將進行的下一次cDNA運行將產生超過800萬個讀數，甚至可能超過1000萬。

我敢打賭，納米孔人們（當然！）在以下兩個關鍵方面做了很多優化：

1. DNA淨化
2. 文庫製備
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我認為對於大多數DNA提取而言，清理的差異可能很大，但是如果您可以使用並使用Blue Pippin之類的工具，它們將發揮出色的作用（它們將無法工作對於無法通過凝膠移動的超長DNA片段）。 Blue Pippin也可以選擇大小，因此您不會消耗過多的小東西而消耗毛孔。

這完全取決於庫的準備工作，@ gringer的答案對此提供了一些不錯的提示。

我正在使用真菌，並且正在使用CTAB方法進行DNA提取，並且我使用了快速試劑盒進行初始文庫製備，但是它沒有用，並且自從我使用連接試劑盒以來，它一直給我帶來很好的結果。我設法獲得了4GB到13GB的數據。