要從BWA映射的BAM文件中排除所有可能的多映射讀取，看來您需要在未壓縮的SAM字段上使用 grep ：

  samtools視圖-h mapping.bam | grep -v -e'XA：Z：'-e'SA：Z：'| samtools視圖-b > unique_mapped.bam  

解釋如下……

我將假設一種情況，其中有一個生物信息學家被提供了一個映射的BAM文件。由BWA製作，無法獲得原始讀物。一種高效的解決方案是從BAM文件中提取映射的讀段，並使用使用MAPQ得分指示多個映射的其他映射器重新映射。

...

我對BWA輸出的理解是，如果讀段完美地映射到多個基因組位置，則兩個位置的映射質量（MAPQ）得分都很高。許多人期望映射到至少兩個位置的讀段最多（最多）有50％的概率映射到這些位置之一（即MAPQ = 3）。由於BWA不會這樣做，因此很難使用適用於其他對齊程序的MAPQ過濾器從BWA結果中過濾出多映射讀取。這很可能就是為什麼Biostars []上當前答案不起作用的原因。

下面是我從BWA mem對齊中獲得的示例行剛剛做了。這些是Illumina的讀取映射到具有很多重複序列的寄生蟲基因組：

  ERR063640.7 16 tig00019544 79974 21 21M2I56M1I20M * 0 0 TATCACATATCATCCGACTCAGCTCGACGAGTACAATGCTAATTTAACACTTAGAATGCCCGGCAATGAAATTCGTTTTCCGTCAATTCTTGAAAATTTC <AABBEGABFJKKKIM7GHKKJK>JLKLDGMHLIMIHHCGIJKKLJKLNJGLLLKLILKLMFNDLKGHJEKMKKMIJHGLOJLLLKIJLKKJEJLIGG>D NM：ⅰ ：4 MD：Z：83A13 AS：i：77 XS：i：67 XA：Z：tig00019544，-78808,21M2I56M1I20M，6; tig00019544，-84624,79M1I20M，6; tig00019544，-79312,33M4I42M1I20M，8;  代碼> 

BWA mem已發現該特定讀物ERR063460.7映射到至少三個不同的位置：tig00019544，tig00019544和tig00019544。請注意，此讀取的MAPQ為21，因此即使讀取映射到多個位置，也不能使用MAPQ來確定。

但是，通過 XA 標記。也許只對包含 XA 標記的行進行過濾就可以排除乘法映射讀取。 samtools視圖手冊頁建議 -x 將過濾出特定標記：

  $ samtools視圖-x XA output.bam |的grep'^ ERR063640 \ 0.7 [[：空間：]]'ERR063640.7 16 tig00019544 79974 21 21M2I56M1I20M * 0 0 TATCACATATCATCCGACTCAGCTCGACGAGTACAATGCTAATTTAACACTTAGAATGCCCGGCAATGAAATTCGTTTTCCGTCAATTCTTGAAAATTTC <AABBEGABFJKKKIM7GHKKJK>JLKLDGMHLIMIHHCGIJKKLJKLNJGLLLKLILKLMFNDLKGHJEKMKKMIJHGLOJLLLKIJLKKJEJLIGG>D NM：I：4 MD：Z：83A13為：I：77 XS：I：67 代碼> 

...，因此它過濾出了標籤（即，該標籤不再存在於SAM輸出中），但沒有過濾出 read 。在FLAG字段中沒有有用的位來指示多個基因組映射（我知道也可以過濾以排除讀取的序列），因此我不得不求助於其他措施。

在這種特殊情況下，我可以在未壓縮的SAM輸出上使用 grep -v 來排除具有 XA 標記的對齊行（並在以後重新壓縮為BAM，以便保持整潔）：

  $ samtools視圖-h output.bam | grep -v'XA：Z：'| samtools視圖-b > output_filtered.bam $ samtools視圖output_filtered.bam | grep'^ ERR063640 \ .7 [[：space：]]'<no output>  

萬歲！讀取已過濾。稍微說一下，此 grep 搜索具有相當大的計算量：它正在一行中某處尋找帶有文本 XA：Z：的字符串。實際捕獲所有情況。某些受虐狂可能會在以後出現，並決定將其所有讀物稱為 HAXXA：Z：AWESOME！：<readNumber> ，在這種情況下，需要對該grep搜索進行調整確保在 XA：Z：之前有一個空格（或更具體地說，是製表符）。

現在，我要檢查 any 重複的讀取名稱，只是為了確保：

  $ samtools視圖output_filtered.bam | awk'{print $ 1}'|排序Uniq -dERR063640.1194ERR063640.1429ERR063640.1761ERR063640.2336ERR063640.2825ERR063640.3458ERR063640.4421ERR063640.4474ERR063640.4888ERRERR640640.49ERR063640.4974ERR063640.5070ERR063640.5130ERR063640.5300ERR063640.5868ERRERR640.6116ERR063640.6063ERR063640.606306306306306306306306306306306306306306363 7900ERR063640.8115ERR063640.8405ERR063640.911ERR063640.9206ERR063640.9765ERR063640.9986  

哦...該死。我想知道它們是什麼：

  $ samtools視圖output_filtered.bam |的grep'^ ERR063640.3458 [[：空間：]]'ERR063640.3458 16 tig00002961 5402 60 58S38M * 0 0 AGGTACCATTCGATAGAGGGAGAAAGGCACTACTAAAGATTTTGCCACATTTGCTATATCCGTATCGCGAAGATCAGGACTTACTCCGCAGAAGAA DD6HFFJBKFH = KDILKLGLJEKLKGFJIH8IKHLLMJEK：L：HBGJIHJKFLLKIHJDHLNKCK; KMKGMFKJILIIIMKI9JLKKHEJFII CC NM：I：0 MD：Z：38 AS：ⅰ ：38 XS：I：0 SA：Z：tig00002377,202353， - ，14M3I5M1I35M38S，19,5; ERR063640.3458 2064 tig00002377 202353 19 14M3I5M1I35M38H * 0 0 AGGTACCATTCGATAGAGGGAGAAAGGCACTACTAAAGATTTTGCCACATTTGCTATA DD6HFFJBKFH = KDILKLGLJEKLKGFJIH8IKHLLMJEK：L：HBGJIHJKFLLKIHJ NM：I：5 MD位：Z ：5G48 AS：i：35 XS：i：27 SA：Z：tig00002961,5402，-，58S38M，60,0; ​​ 

啊哈！補充比對，它使用 official SA 標籤[嵌合比對中的其他規範比對]。這些情況似乎是單個讀取被拆分並映射到多個位置的情況。請注意，在這種情況下， 這兩個比對的MAPQ得分仍然超過3 。聽起來，發問者也希望擺脫這些情況。這次，也有標準標誌字段來處理這些情況（0x800：輔助對齊）。僅僅過濾補充對齊是不夠的，因為應該刪除兩者讀取映射，而不是僅僅刪除那些偶然被標記為輔助映射的映射。

幸運的是，BWA似乎將 SA 標記放入包含補充比對的所有讀取中（如果不是這種情況，我相信有人會對此進行糾正）。因此，我在 SA 搜索中添加了一個附加的 grep 過濾器：

  $ samtools視圖-h output.bam | grep -v -e'XA：Z：'-e'SA：Z：'| samtools視圖-b > output_filtered.bam $ samtools視圖output_filtered.bam | awk'{print $ 1}'|排序uniq -d<no output>  

完成。十分簡單！ < / sarcasm>

......使用不同的定位器的原始“高效”解決方案現在看起來還不錯。

對於更快，更穩定的 ^{$ sup>實現，sambamba可以使用以下一種方法來處理此問題：}

  sambamba視圖-t 12 -h -f bam -F “ mapping_quality > = 1，而不是（未映射或secondary_alignment），並且不是（[XA]！= null或[SA]！= null）”。test.bwa-mem.bam -o test-uniq.bam  有關進一步使用的詳細信息，請參見手冊和 sambamba synatx。 
 $：除了 grep 緩慢的搜索，可能會返回錯誤的正 del>否定命中（上面@gringer的回复）。我也不認為基於 awk 的方法可靠，因為XA，SA等字段是 SAM格式的可選字段，而不是按位置固定的字段。